技术负责人：郜鹏

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关键词：光学显微、三维成像、荧光相关光谱

项目概况：

（一）项目背景

开发集成光学显微和荧光相关光谱技术的高通量多参数活细胞成像分析仪在当今生物医学等领域研究中发挥着举足轻重的作用，具有广阔的市场前景。其中，超分辨光学显微技术突破了传统光学显微镜分辨率的衍射极限，以几十纳米甚至几个纳米的空间分辨率观测样品的微观结构，在生物医学研究中发挥了革命性作用。荧光相关光谱仪（FCS）能快速定量获得蛋白质等生物大分子的高内涵信息（分子浓度、粒径、扩散系数、相互作用等），逐渐成为研究疾病发病和治疗机理的重要手段。据美国Grand View Research公司统计，2023年全球光学显微镜市场规模约为40亿美元，并以5.2%的复合增长率增长。其中，以超分辨光学显微镜为代表的高端光学显微镜拥有百亿级的市场规模。然而，目前主流的高端光学显微镜几乎被蔡司(德国)、徕卡（德国）、奥林巴斯(日本)、尼康（日本）等外国企业所垄断；同样，主流的FCS测量系统为德国Picoquant、美国尼通公司等国际巨头所垄断。本项目参研单位——中科奥辉科技有限公司是国内唯一研发生产FCS设备的公司。本项目紧跟国家“科技仪器设备国产化”的战略导向，致力于研发集超分辨光学显微和荧光相关光谱技术于一体的高通量多参数活细胞成像分析仪并向产业推进，期望改变我国在活细胞成像分析仪领域的市场格局。

（二）项目简介

本项目针对当前生物医学研究中对细胞超分辨成像和细胞内蛋白质等生物大分子多参数特征获取的迫切需求，开发集成共振扫描结构光照明显微（RS-SIM）和共振线扫FCS(RS-FCS)技术的高通量多参数活细胞成像分析仪，并向产业推进。RS-SIM利用共振扫描代替传统SLM/DMD投影产生条纹结构光，突破了传统SIM成像通量受到投影器件限制的瓶颈，实现大视场超分辨活细胞结构和形态成像；同时，RS-FCS采用共振线扫技术获得细胞中不同位置处蛋白质等生物大分子的浓度、直径、扩散系数、相互作用等多参数信息，克服了传统FCS仅能获得细胞内单点生物大分子动态信息的局限。该设备在高内涵药物筛选和生物医学研究等领域有着广阔的应用前景；通过联合广东中科奥辉科技有限公司，致力于实现该设备的工程化和产业化，进一步推进核心部件的国产化，最终研制出一款高通量、多参数的活细胞成像分析仪。

（三）关键技术与创新点

本项目针对当前生物医学研究对超分辨细胞结构成像和蛋白质等生物大分子多参数信息获取的迫切需求，开发集共振扫描结构光照明显微（RS-SIM）和共振线扫FCS(RS-FCS)技术于一体的高通量多参数活细胞成像分析仪。通过攻克高通量结构光照明（RS-SIM）超分辨显微技术和共振线扫荧光相关光谱（RS-FCS）技术等关键技术，致力于实现高通量、多参数活细胞成像分析仪（图1）核心部件的国产化，并与中科奥辉公司合作在杭州推进该设备的产业化。

图1 高通量细胞多参数成像分析仪技术及产业化研发

1、关键技术一共振扫描结构光照明显微（RS-SIM）

共振扫描结构光照明显微技术（简称RS-SIM）的光路，如图2所示。波长可选的四色激光器（405nm，488nm，561nm，640 nm）发出的光经扩束准直后作为照明光。接着，利用一个二维扫描振镜（Scanner）对该照明光进行扫描。在扫描过程中，一电光调制器（EOM）对照明光光强进行调节，以产生具有不同方向和不同周期的结构光。具体地，在二维扫描中，x方向由GM₁实现频率为12kHz的共振扫描，y方向上由GM₂实现频率为1kHz的线性扫描。该扫描结构光被成像到样品上，激发的荧光信号则被成像系统MO-TL₂成像到sCMOS上。通过同步控制EOM和光束扫描产生方向互成120^o、相移量分别为、、6幅结构光，并由sCMOS记录样品在这9幅结构光照明下的强度图样，利用传统SIM超分辨重建方法可以获得样品的超分辨荧光图像。通过采用双色（脉冲）交替激发还可以实现双色交替成像。

该方法通过共振扫描聚焦光斑来产生条纹结构光，可以在大视场内快速产生海量结构光，克服了传统SIM条纹结构光受SLM-DMD投影器件像素个数的限制，并将有效成像通量（视场/分辨率）由1.5M提高至15M。此外，聚焦光斑可以更好地克服样品对激发光的散射作用，从而将SIM的成像深度由几十微米提高至几百微米（与共聚焦显微镜对等的水平）。

图2 共振扫描结构光显微光路示意图；插图：扫描SIM结构光示意图。

关键技术二：共振线扫荧光相关光谱（RS-FCS）技术

利用图2所示的实验装置，还可以开展共振线扫荧光相关光谱(RS-FCS)测量，获得生物大分子的多参数信息。通过共振振镜沿着x方向重复扫描一条线（如图3(a)所示），并利用sCMOS依次记录扫描区域对应的图像序列。为实现高速成像，sCMOS相机采用20248像素的局部开窗曝光模式，其帧频可达26 kHz。从所记录的窄带图像序列中可以获得扫描线上不同点x_i随时间变化的强度分布F_i(t)，通过计算扫描方向上相距的两点x_i与x_j的自相关和两者之间的互相关（图3(b)），以及利用三维扩散模型对其进行全局拟合，可以获得细胞内不同位置处生物大分子的密度、扩散速率、分子直径等参数。与传统线性扫描的FCS（扫描1k Hz）相比，RS-FCS利用共振扫描将时间分辨率提高了1个数量级，非常适合于捕捉快速运动的生物大分子的动态过程。

图3 共振线扫荧光相关光谱技术。(a) 共振线扫示意图；(b) 共振线扫FCS的自相关和互相关曲线。

本项目创新点包括：

（1）提出了扫描结构光照明超分辨RS-SIM显微技术，通过共振扫描聚焦光斑并结合时序光强调制形成结构光条纹，克服了传统SIM成像视场/通量小的缺点。

（2）提出了共振线扫FCS技术，可定量获得细胞中不同位置处生物大分子的浓度、直径以及扩散系数等信息。通过引入共振扫描，将传统线扫FCS的时间分辨率提高了10倍。

技术成果清单：

技术成熟度：

概念验证  原理样机  工程样机  中试  产业化

合作方式：

联合研发  技术入股  转让  授权（许可）  面议